細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書

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產品詳情

 產品描述

漿核蛋白的分離提取屬于生物學研究的重要實驗之一，對于探究細胞中的不同組分以及蛋白在細胞中的定位具有重要的意義，促進亞細胞蛋白組學發展，提取的核蛋白可以用于后續轉錄調控方面研究，例如Pull Down，EMSA，footprinting等，為分子機制深入探索提供可靠技術支持。

基本原理如下：細胞在低滲條件下胞膜會發生脹破，釋放漿蛋白，離心得到細胞核沉淀，最后利用高鹽溶液抽提得到核蛋白，本試劑盒利用該原理，優化配方組分和提取方法提供了一種高效提取漿核蛋白的方法，較大保持蛋白的天然活性，同時漿蛋白與核蛋白之間存在極少的交叉污染，為后續研究提供可靠的樣本。本試劑盒只適用于細胞樣品的核漿蛋白提取，每T約適用于約一個大皿細胞量的提取。

產品組成

運輸與保存

-20℃保存，一年有效

實驗步驟

1.試劑準備：

室溫溶解試劑盒中三種組分，溶解后混勻冰上放置備用

（1）自備100 mM PMSF母液；

（2）漿蛋白抽提工作液：用細胞漿蛋白抽提試劑A將試劑C稀釋至1X用，臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM（現配現用）；

（3）核蛋白抽提工作液：用細胞漿蛋白抽提試劑B將試劑C稀釋至1X用，臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM（現配現用）。

2. 收集細胞沉淀

①對于貼壁細胞：棄去原來培養基，PBS清洗一遍，用細胞刮或消化收集細胞沉淀，盡可能吸凈上清，留下沉淀備用（推薦使EDTA溶液代替胰酶消化，以免胰酶殘留降解目的蛋白；每個樣品可用小離心機或原來離心機進行二次離心，充分棄去殘留上清以保證后續提取效果不受影響）；②對于懸浮細胞：離心收集細胞，PBS清洗一遍，盡可能吸凈上清，留下沉淀備用。

3. 漿蛋白的提取

（1）約50 μL體積的細胞沉淀中加入200 μL細胞漿蛋白抽提工作液，反復吹打混勻十多次至沉淀散離，冰浴10 min后再次吹打混勻十多次，繼續冰浴裂解5 min。

（2）高速劇烈渦旋5s，4℃ 600g離心5 min，此時得到的沉淀為細胞核沉淀，上清為粗提的漿蛋白，將此上清再次4℃ 12000g離心10 min去除雜質即得到純凈的細胞漿蛋白。

4.核蛋白的提取

（1） 對于步驟3-(2)中獲得的細胞核沉淀加入400 μL細胞漿蛋白抽提試劑A（此時使用的試劑A不含試劑C），吹打混勻十多次至沉淀分散，4℃，冰浴5 min 600 g離心5 min，棄去上清保留沉淀，得到的沉淀重復該操作一次，最后盡最大努力棄去上清保留沉淀。

（2）對于步驟4-(1)中獲得的沉淀加入100 μL細胞核蛋白抽提工作液，冰浴裂解30min，期間多次渦旋振蕩10-15s以充分裂解（核蛋白裂解后，如果條件允許建議使用超聲以大功率的提取核蛋白，增加蛋白質的溶解度，提高實驗結果一致性，超聲3次，每次5秒，功率90w）。

（3）4℃ 12000g離心10 min收集上清為細胞核蛋白。抽提得到的漿核蛋白可立即使用，也可-80℃保存備用。

實驗案例分析

細胞刮收集A549，H1299，Hela三種細胞沉淀樣品，每種細胞約一個大皿的細胞量，按照試劑盒使用說明進行核漿蛋白的分離提取，得到的漿蛋白和核蛋白用于western blot分析，考察其核漿分離效果，結果如下圖所示：

圖3.三種細胞樣品的漿核蛋白western blot分析結果

注意事項

（1）需自備PMSF。PMSF母液用無水乙醇配制，臨用前2-3 min內加入，以免在水溶液中很快失效；

（2）所有的抽提步驟都需要在冰上或者4℃進行；

（3）本試劑盒只適用于細胞樣品漿核蛋白的提取分離，提取到的蛋白樣品可直接用BCA法進行蛋白濃度測定；

（4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套；

（5）本產品僅作科研用途！