一、產品描述

貨號： R180（亦作R180-100 / 78R180）

英文名稱： Red Retrobeads™ IX (100 µl)

中文名稱： Lumafluor 紅色逆向示蹤熒光微粒 IX（100微升）

品牌： Lumafluor

產地： 美國

規格： 100 µl/支（濃縮液，蒸餾水中懸浮）

核心成分： 羅丹明（Rhodamine）標記的熒光聚合物微球，粒徑范圍約50–200 nm（混合粒徑分布），微球濃度約為1×10? beads/ml

激發/發射波長： 最大激發波長約530 nm，最大發射波長約590 nm

熒光顏色： 紅色

包裝形式： 密封小瓶，內含濃縮微球懸浮液

特約代理經銷商（中國區）：上海起發實驗試劑有限公司

應用領域： 神經科學、細胞生物學、發育生物學、藥物遞送研究、活體示蹤研究、免疫組織化學、原位雜交

適用物種： 小鼠、大鼠、斑馬魚、非人靈長類等哺乳動物及冷血動物

供貨周期： 現貨

保質期： 正確儲存條件下可保持數年穩定；建議一年內使用完畢以獲得最佳效果

 二、產品特點

1. 經文獻充分驗證的有效性

Retrobeads™ 是Lumafluor公司原創開發的逆向示蹤熒光微球產品，其有效性已被數百篇同行評議研究論文所證實，覆蓋從無脊椎動物到靈長類動物的多種實驗系統。相關研究成果發表于《Nature》《Science》《Neuron》《Nature Communications》《Cell Reports》等學術期刊。目前綠色和紅色熒光Retrobeads™僅由Lumafluor供應。

2. 強烈的熒光信號

R180采用羅丹明熒光染料封裝技術，微球發出明亮且穩定的紅色熒光。在復雜的生物組織環境中，神經元示蹤信號清晰可見，實驗觀察的靈敏度和準確性較好。即使在較長時間的光學觀察或顯微攝影過程中，微球熒光信號也不易出現明顯衰減。

3. 精準的逆行示蹤能力

該微球通過物理注射導入目標神經區域后，可被神經末梢攝取并沿軸突逆向運輸至神經元胞體，從而實現對神經元投射路徑的精準標記。注射后微球在注射位點擴散范圍通常小于1 mm，適合精細神經環路的連接組學研究。

4. 良好的生物相容性

R180紅色逆行示蹤微球對活細胞或活體無毒，在實驗過程中不會對神經元的正常生理活動產生明顯干擾，也未觀察到引起細胞損傷或死亡的明確證據。微球已通過FDA Class VI生物材料認證，支持清醒動物在體實驗。

5. 長期穩定性

在正確儲存和使用條件下，R180的熒光信號在體內可維持14個月以上無明顯質量下降，細胞內標記可長期留存。這一特性使其適合需要長期追蹤的神經科學研究項目。

6. Retrobeads™ IX系列的增強功能

R180屬于IX（Improved eXperience）改進型產品，相比經典款R170具有以下升級特性：微球表面經特殊處理，促進蛋白質及其他生物活性化合物的吸附；可將神經營養因子、神經遞質激動劑/拮抗劑等多種生物活性物質遞送至局部區域，通過逆行轉運確定哪些神經元暴露于這些化合物；在靈長類動物系統中的示蹤效率優于標準Retrobeads™。

7. 廣泛的兼容性

R180與大多數其他順行示蹤劑（如BDA）、病毒載體、納米顆粒、原位雜交檢測技術及免疫組織化學技術兼容?？膳cGFP/YFP等熒光蛋白聯合使用而無光譜重疊干擾。

8. 多尺度、多物種適用性

已成功應用于小鼠、大鼠、斑馬魚胚胎及非人靈長類動物。支持從單細胞層面（30–50 µm玻璃電極微量注射）到全腦網絡層面（多點注射）的多種研究需求，適配立體定位注射儀。

 三、儲存條件

儲存溫度： 4°C冰箱冷藏保存

環境要求： 存放于加濕容器中，防止溶液蒸發

避光要求： 建議避光保存

嚴禁冷凍： 冷凍會導致微球失效，且無法挽回。被凍結的微球將全喪失示蹤功能。

嚴禁干燥： 若微球溶液變干，無法重新懸浮恢復，視為報廢。

有效期： 在正確儲存（4°C避光冷藏、密封防蒸發、不冷凍）的條件下，產品可保持穩定數年。盡管未設定明確的貨架壽命上限，但建議在收到產品后一年內使用完畢，以獲得最佳實驗效果。

反復凍融： 必須避免。每次取用后應立即放回冰箱冷藏。

 四、工作原理

1. 逆行示蹤的基本原理

R180的工作原理基于神經元軸突運輸機制。當微球懸浮液被注射到目標腦區或神經組織后，局部神經末梢通過內吞作用攝取這些熒光微球。微球隨后被裝入逆向運輸囊泡，沿軸突以逆向（從末梢向胞體）方向運輸，最終富集于神經元的胞體內?？蒲腥藛T在后續切片觀察時，即可在熒光顯微鏡下直接識別被標記神經元的胞體位置，從而繪制出該腦區接收輸入的神經元來源圖譜。

2. 熒光標記的持久性

與傳統示蹤劑（如辣根過氧化物酶HRP，標記通常僅維持數周）不同，熒光微球的信號不依賴細胞的代謝活性來維持。羅丹明染料被封裝在聚合物微球基質內部，受到物理保護，不易被光漂白或酶降解。這使得標記信號可以在活細胞中無限期存續（超過1年），且不隨細胞分裂或時間推移而顯著衰減。

3. IX改進型的生物活性物質遞送功能

Retrobeads™ IX系列在微球表面進行了化學修飾，使其更易吸附蛋白質和其他生物活性分子。研究人員可將微球預先與神經營養因子（如NGF、BDNF）或神經遞質受體激動劑/拮抗劑孵育，使這些物質吸附于微球表面。注射后，微球在逆行運輸過程中將所攜帶的生物活性物質遞送至神經元胞體，實現局部、靶向的功能干預。通過檢測哪些神經元被標記，即可確定哪些細胞群接受了活性物質的作用。

4. 熒光激發與檢測

R180中的紅色熒光染料為羅丹明，最大激發波長約530 nm，最大發射波長約590 nm。在熒光顯微鏡下使用標準羅丹明濾光片組即可檢測。蔡司（Zeiss）和徠卡（Leitz/Leica）的標準羅丹明濾光片組均可獲得良好的觀察效果。與共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、光片顯微鏡等多種成像設備兼容。

 五、解決實驗中的哪些問題

1. 傳統示蹤劑標記時間短

HRP（辣根過氧化物酶）等傳統示蹤劑的標記信號通常僅能維持數周，無法滿足長期追蹤實驗的需求。R180在體內可穩定標記超過1年，適合慢性實驗、發育研究及長期神經可塑性觀察。

2. 示蹤劑擴散范圍難以控制

許多化學示蹤劑在注射后會沿組織間隙擴散，導致標記區域不精確。R180注射后擴散范圍通常小于1 mm，注射位點高度局限，適合精細的局部 connectivity 研究和小型核團標記。

3. 標記信號的光漂白問題

常規熒光染料在長時間光照下容易光漂白，影響成像質量。R180的微球結構將染料封裝保護，即使經過長時間觀察或多次拍攝，熒光信號也不易出現明顯衰減。

4. 多色標記與多技術聯用需求

在需要同時標記多條神經通路或結合其他檢測技術的實驗中，R180提供紅色熒光通道，可與綠色熒光微球（G180）、病毒示蹤劑、免疫組化、原位雜交等技術聯合使用，互不干擾。

5. 活體/清醒動物實驗的安全性

部分示蹤劑對活體具有毒性或需要通過病毒載體實現標記。R180對活細胞和活體無毒，已通過生物安全性認證，適用于清醒動物在體實驗，也支持尾靜脈注射等全身性給藥方式。

6. 靈長類動物中的示蹤效率

標準逆行示蹤劑在靈長類動物大腦中的標記效率往往不理想。R180作為IX改進型產品，在靈長類系統中的示蹤效果優于標準Retrobeads™，已成功應用于靈長類動物視覺皮層投射圖譜繪制等研究。

 六、使用方法

第一步：實驗準備

從4°C冰箱中取出R180微球溶液，檢查溶液狀態。正常產品應為均勻的紅色懸浮液。如發現有沉淀，可輕輕渦旋或吹打混勻，避免劇烈振蕩產生氣泡。根據實驗設計確定注射方案。

第二步：稀釋（如需要）

R180紅色微球可原液使用，也可進行稀釋。在大鼠視覺皮層實驗中，1:4稀釋度（如用無菌PBS或蒸餾水按1份微球加3份稀釋液）經驗證不會降低逆行標記的質量或范圍。除蒸餾水外，標準鹽溶液（NaCl、KCl）也可作為稀釋劑。對于初次實驗，強烈建議使用原液全強度注射，以確保獲得可靠的標記效果。綠色微球（G180）不建議稀釋，需原液使用。

第三步：動物麻醉與固定

以嚙齒類動物為例，使用異氟烷等吸入麻醉劑麻醉動物，將其頭部固定于立體定位儀（stereotaxic frame）上。維持麻醉深度約1.5%–2.5%異氟烷。手術暴露顱骨后，根據腦圖譜確定目標坐標，進行開顱。

第四步：微量注射

R180適合使用壓力注射系統進行注射。常用配置包括1 mL漢密爾頓（Hamilton）微量注射器或氣動注射系統（如Picospritzer）。對于小范圍局部環路研究，可使用直徑30–50 µm的玻璃微量移液管，注射體積約30–50 nL。對于常規逆行示蹤，可使用較大口徑的注射針頭，注射體積約0.1–0.3 µL。注射速度建議控制在70–100 nL/min左右。注射完成后，留針等待數分鐘再緩慢撤針，以減少回流。

由于微球注射后擴散范圍有限（<1 mm），如需標記投射至較大核團的全部神經元，需要在目標區域內進行多點注射。不推薦使用離子透入法（iontophoresis）進行微球示蹤。

第五步：術后恢復與存活期

溫血脊椎動物的最短有效存活期為注射后約24小時。標記強度在48小時內隨時間遞增，48小時后趨于穩定。大多數實驗選擇術后存活7–14天再進行灌注取材。最長可檢測期尚未確定，但注射后14個月的標記質量和范圍未見明顯變化。冷血動物建議初始存活期設為1周。

第六步：灌注固定

以0.1 M磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）經心臟灌注沖洗血液，隨后用4%多聚甲醛（PFA，溶于0.1 M磷酸緩沖液，pH 7.4）灌注固定。固定時間視組織大小而定，通常為1–3天（4°C后固定）。

注意：避免使用戊二醛（glutaraldehyde）。 戊二醛會引起明顯的組織自發熒光，可能遮蔽微球標記信號。綠色微球在戊二醛固定的樣本中尤其不可見。

第七步：切片制備

將固定好的腦組織取出，可在OCT包埋后于冰凍切片機（cryostat）上切制冠狀面或其他所需方位的切片。常用切片厚度為16–60 µm，推薦30–40 µm。切片收集于磷酸緩沖液中，貼附于明膠包被的載玻片上，室溫空氣干燥。

第八步：封片與觀察

切片充分干燥后，可用二甲苯透明約1分鐘，隨后使用Fluoromount™或Krystalon等封片劑封片。封片時建議使用抗淬滅封片劑，以更好地保護熒光信號。

注意： 微球對甘油敏感，含甘油的封片劑會導致熒光快速淬滅，應避免使用。水楊酸甲酯（methyl salicylate）可作為甘油的替代選擇。酒精和二甲苯短時間接觸（<5分鐘）對微球無害，但長時間暴露（超過5分鐘）會破壞微球。

封片后的載玻片如保存在暗處，細胞內的標記信號至少1年內不會明顯褪色（盡管組織自發熒光背景可能隨時間增加）。

 七、顯微鏡觀察建議

濾光片選擇： R180使用羅丹明濾光片組檢測。蔡司和徠卡的標準羅丹明濾光片均可獲得良好效果。部分老款尼康羅丹明濾光片組背景較高，可能影響標記細胞的識別，建議避開。

物鏡選擇： 低倍率、低數值孔徑的干鏡（如4×、10×）通常難以觀察到標記信號。建議使用數值孔徑0.4以上的10×浸液物鏡或更高倍率的干鏡。25×浸液物鏡往往能清晰呈現低倍鏡下遺漏的標記細胞。在判定實驗是否成功前，務必在注射位點附近使用浸液物鏡仔細檢查切片。

綠色微球補充說明： 綠色微球的激發波長較短（最大激發約460 nm），組織自發熒光干擾更為顯著。建議使用寬波段熒光素濾光片（narrow-band FITC濾片信號較弱）。為降低背景，可采取以下措施：使用更薄的切片（如30 µm而非40–50 µm）；選用幼年動物（P14之前），其組織自發熒光更低且運輸效率更好；封片后盡快觀察（背景會隨時間增加）。

 八、常見問題與解決方案

問題一：注射后未觀察到標記信號

可能原因及對策：注射體積過小或注射位點偏離目標區域。建議實驗使用原液全強度注射，注射量不低于0.1 µL。使用更大直徑的玻璃電極或多點注射覆蓋目標區域。此外，務必使用浸液物鏡在注射位點附近仔細檢查，低倍干鏡容易遺漏信號。存活時間不足24小時也可能導致標記不充分，建議至少等待48小時再取材。

問題二：標記信號弱

可能原因及對策：微球可能未充分混勻，使用前請輕輕渦旋。如使用了稀釋液，建議改回原液注射進行對比。注射速度過快可能導致微球在針尖聚集堵塞，建議控制在70–100 nL/min。檢查濾光片組是否匹配——羅丹明濾光片為必需。

問題三：背景熒光過高，標記信號被掩蓋

可能原因及對策：固定過程中使用了戊二醛，應改用4%多聚甲醛。切片厚度過大也會加劇背景，建議控制在30–40 µm。如使用綠色微球，建議選用幼年動物并盡快觀察。載玻片放置時間過久會導致背景自發熒光增加，建議封片后盡早成像。

問題四：微球擴散范圍超出預期

R180本身的擴散范圍通常小于1 mm，如觀察到更大范圍的擴散，可能與注射體積過大或注射速度過快有關。建議降低注射量至30–50 nL/點，并使用更細的玻璃電極（30–50 µm）進行精確注射。

問題五：能否與其他示蹤劑或病毒聯用

可以。R180已驗證可與病毒載體（如AAV、慢病毒）、傳統順行示蹤劑（如BDA、CTB）、納米顆粒等聯合使用。在多重標記實驗中，R180的紅色通道（530/590 nm）與GFP/YFP等綠色熒光蛋白無光譜重疊，可實現雙色或多色標記。

問題六：微球是否可以用于體外實驗

可以。R180適用于體外實驗，包括細胞培養、膜片鉗記錄、流式細胞分選等。微球可用于標記培養中的神經元，也可用于細胞爬片的示蹤研究。

問題七：IX版本與經典版（R170）有何區別，如何選擇

R180（Red Retrobeads™ IX）在R170經典款的基礎上增加了生物活性物質吸附功能，表面化學修飾使其能更有效地攜帶蛋白質、神經營養因子及神經遞質相關化合物。IX版本在靈長類動物系統中的示蹤效率更高。如實驗僅涉及常規逆行示蹤，R170已能滿足需求；如需遞送生物活性物質或在靈長類中做示蹤，建議選擇R180。

問題八：產品儲存超過1年還能用嗎

在正確儲存條件（4°C避光冷藏、密封防蒸發、未冷凍、未干燥）下，R180可保持穩定超過3年。每次使用前檢查溶液外觀是否正常（均勻的紅色懸浮液），如發現變色、沉淀無法重懸或瓶內液體已干涸，則不應繼續使用。

 九、注意事項與安全信息

1. 本產品僅用于科學研究，不可用于人類或動物的臨床診斷或治療。

2. 操作時應穿戴實驗服和一次性手套，避免直接接觸皮膚或吸入氣溶膠。

3. 注射操作應在生物安全柜或通風櫥內進行，遵守動物實驗倫理規范。

4. 產品不可冷凍，冷凍后微球將失效。

5. 產品不可干燥，干燥后無法重懸恢復。

6. 避免使用含甘油的封片劑，推薦Fluoromount™、Krystalon或專用抗淬滅封片劑。

7. 固定時避免使用戊二醛，推薦4%多聚甲醛。

8. 酒精和二甲苯透明步驟應控制在5分鐘以內。

9. 如進行塑料包埋（plastic embedding），目前尚未證實能成功保留微球標記信號。

10. 廢棄液應按照實驗室生物廢棄物處理規范處置。

 十、訂購信息

R170 — Red Retrobeads™（經典款紅色），規格 100 µl

R180 — Red Retrobeads™ IX（改進型紅色），規格 100 µl

G180 — Green Retrobeads™ IX（改進型綠色），規格 100 µl

以上產品均為Lumafluor原廠出品，100 µl/支濃縮液包裝。

中國區特約代理經銷商為上海起發實驗試劑有限公司，可通過其獲取產品信息及采購。

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更多產品信息，請聯系Lumafluor中國區域特約代理經銷商：上海起發實驗試劑有限公司

（注：本文內容基于品牌公開資料及行業常規信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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