【產品描述】

貨號：G180

英文名稱：Green Retrobeads™ IX

中文名稱：綠色逆向示蹤熒光微粒（綠色逆行示蹤微球）

品牌：Lumafluor, Inc.（美國）

規格：100 µl（液體懸浮液，濃縮原液）

熒光顏色：綠色

激發波長（Excitation）：約 480 nm

發射波長（Emission）：約 520 nm

核心成分：聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯基微球，表面共價偶聯綠色熒光染料

溶劑體系：水性懸浮液，含表面活性劑以維持分散穩定性

微球直徑：約 0.02–0.2 µm（典型值，具體以批次檢測報告為準）

濃度：約 10% 固體含量（w/v），可根據實驗需求稀釋

適用物種：大鼠、小鼠、非人靈長類及其他哺乳動物

應用領域：神經科學、神經解剖學、神經環路追蹤、腦圖譜繪制、神經元連接組學、藥物遞送研究

儲存溫度：4°C 避光保存

有效期：自生產日期起 12 個月（具體以瓶身標注為準）

原產國：美國

運輸條件：冷藏運輸（4–8°C）

安全提示：僅供科研使用，非臨床用途；操作需佩戴防護手套與護目鏡

中國區域供應商：上海起發實驗試劑有限公司

【產品特點】

1. 高熒光強度與高信噪比

 微球內部包埋高濃度綠色熒光染料，熒光信號強，背景自發熒光低，在熒光顯微鏡下呈現明亮綠色熒光，便于低倍鏡掃描與高倍鏡精確定位。

2. 逆向（逆行）運輸效率高

 微粒尺寸經優化設計，可被神經末梢高效內吞，并沿軸突逆向運輸至胞體，實現"從靶區反推起源"的示蹤策略，標記效率穩定可靠。

3. 長期體內穩定性

 熒光信號在固定組織中可保持數月不褪，適合長時程實驗（數周至數月）。經醛類固定后熒光保留良好，兼容石蠟包埋與冰凍切片。

4. 低擴散、低泄漏

 微球被神經元內吞后不易逸出細胞膜，注射位點周圍擴散范圍小，標記邊界清晰，可有效減少"假陽性"誤判。

5. 與紅色示蹤劑高度互補

 綠色熒光通道（FITC/GFP 通道）與 Lumafluor 紅色示蹤微球（如 Red Retrobeads™ IX）光譜無重疊，可在同一組織中實現  雙色或多色逆向示蹤實驗。

6. 即用型制劑

 產品為即用型液體懸浮液，無需溶解、復溶或復雜前處理，開瓶后  短暫渦旋混勻即可上樣，節省實驗準備時間。

7. 表面化學性質可控

 微球表面經過修飾處理，具有適度的親水性與表面電荷，既保證注射順暢不易堵塞針頭，又促進神經末梢的有效攝取。

【儲存條件】

1. 推薦儲存溫度：4°C ± 2°C（標準冰箱冷藏室）

2. 避光保存：建議使用鋁箔包裹瓶身或存放于不透光容器中，避免熒光染料因光照而光漂白

3. 嚴禁冷凍：冷凍會導致微球聚集、破裂或熒光淬滅， 解凍后可能出現不可逆的沉淀

4. 防止干燥：使用后務必擰緊瓶蓋，避免溶劑蒸發導致濃度改變或微球干結

5. 潔凈操作：每次取用前短暫渦旋（5–10 秒）混勻懸浮液；建議使用無菌槍頭，避免交叉污染

6. 有效期：開封后建議在 6 個月內使用完畢；未開封狀態下按標注有效期執行

【工作原理】

G180 的工作原理基于"逆向軸突運輸"（Retrograde Axonal Transport）機制：

第一步 — 注射與沉積

將 G180 懸浮液注射至目標腦區或外周神經靶區。微球以高濃度懸浮狀態沉積在注射位點周圍的組織間隙中。

第二步 — 神經末梢攝取

沉積在靶區的微球被該區域神經末梢通過胞吞作用（endocytosis）主動攝取。微球尺寸經過優化，既足夠小以進入內吞途徑，又足夠大以避免快速被胞吐排出。

第三步 — 逆向運輸至胞體

被攝取的微球包裹于內體/溶酶體囊泡中，借助微管馬達蛋白（dynein 復合物）沿軸突以逆向方向運輸，最終抵達神經元的胞體（soma），在細胞核周圍富集。

第四步 — 熒光檢測

攜帶綠色熒光微球的神經元胞體在熒光顯微鏡下呈現明亮綠色熒光。由于微球不透過細胞膜，信號被"鎖定"在陽性神經元內部，背景干凈。

研究者可據此：

· 確定支配該靶區的所有上游神經元群體

· 繪制腦區之間的連接圖譜

· 結合其他示蹤劑進行多色環路分析

第五步 — 長期保留

微球在神經元胞體內可長期駐留（數周至數月），熒光信號衰減緩慢，適合長時程追蹤實驗。固定后熒光保留良好，可存檔反復觀察。

【解決的實驗問題】

問題一：傳統順行示蹤劑標記方向單一

許多經典示蹤劑（如 PHA-L、BDA）主要實現順行標記，難以回答"哪些腦區投射到此處"的問題。G180 提供逆向視角的補充方案。

問題二：病毒示蹤劑耗時長、操作復雜

病毒載體（如 rabies、HSV）需要數天至數周的擴增表達周期，且涉及生物安全等級要求。G180 注射后數天即可檢測，無需病毒操作設施。

問題三：熒光染料擴散范圍大、定位不準

游離熒光染料（如 Fluoro-Gold、DAPI 等）注射后易沿針道或組織間隙擴散，標記邊界模糊。G180 微球顆粒大、擴散受限，注射位點緊湊，標記精度更高。

問題四：信號持續時間不足

部分染料在固定或包埋過程中熒光嚴重衰減。G180 微球熒光穩定，兼容甲醛/多聚甲醛固定、蔗糖沉糖、OCT 包埋、冰凍切片及后續免疫組化染色。

問題五：多色示蹤光譜串擾

在雙色或多色實驗中，不同示蹤劑的光譜重疊會導致通道串擾。G180 的綠色熒光與紅色 Retrobeads 光譜分離良好，可在同一張切片上清晰區分兩種標記群體。

問題六：注射操作不便

部分示蹤劑為干粉形式，需自行配制且濃度難以控制。G180 為即用型液體，濃度均一，注射體積可控，重復性好。

【使用方法】

以下為典型的大鼠腦內注射操作流程，研究者可根據實際實驗方案進行調整。

步驟一：準備工作

· 從 4°C 冰箱取出 G180，室溫平衡 10–15 分鐘

· 渦旋混勻 10 秒，確保微球均勻懸浮

· 如需要稀釋，使用提供的稀釋液或 0.01 M PBS（pH 7.4）

· 準備立體定位儀、微量注射器（建議 1–10 µl 規格）、 30–33 G 注射針頭

步驟二：動物麻醉與固定

· 按機構動物倫理委員會批準的方案實施麻醉

· 將動物固定于立體定位儀，保持頭部穩定

· 常規消毒手術區域

步驟三：開顱/暴露注射靶點

· 沿中線切開頭皮，剝離骨膜

· 使用顱骨鉆在目標坐標處開一小孔（直徑約 1–2 mm）

· 避免損傷硬腦膜及大腦皮層表面血管

步驟四：裝載示蹤劑

· 用微量注射器吸取適量 G180 懸浮液

· 排出氣泡，確認針尖有液體流出

· 記錄裝載體積

步驟五：緩慢注射

· 將針頭緩慢下降至目標深度（典型速度 0.5–1 mm/min）

· 到達靶點后，以緩慢恒速注射（典型速率 0.1–0.5 µl/min）

· 大鼠常用注射體積：0.2–1.0 µl/位點

· 小鼠常用注射體積：0.05–0.3 µl/位點

· 注射完畢后留針 5–10 分鐘，以減少回流

步驟六：拔針與縫合

· 以緩慢速度（約 1 mm/min）拔出針頭

· 縫合頭皮切口，消毒傷口

· 將動物置于溫暖環境中蘇醒

步驟七：存活期

· 典型存活時間：注射后 3–14 天（依實驗目的而定）

· 較短存活期（3–5 天）適合快速運輸實驗

· 較長存活期（7–14 天）適合長距離逆向運輸或稀疏投射研究

· 期間正常飼養，觀察動物狀態

步驟八：灌注固定與切片

· 深度麻醉動物，經心臟灌注生理鹽水沖洗血液

· 灌注 4% 多聚甲醛（PFA）固定組織

· 取腦，后置固定于 4% PFA 中 4–24 小時

· 轉移至 20%–30% 蔗糖溶液沉糖至組織沉底

· 冰凍切片（典型厚度 30–50 µm），貼片于載玻片

步驟九：封片與觀察

· 使用含 DAPI 的熒光封片劑封片（便于復染細胞核）

· 蓋玻片封固，指甲油封邊

· 熒光顯微鏡下使用 FITC/GFP 濾光片組觀察綠色熒光

· 激發光 480 nm，發射光 520 nm

· 拍照記錄，注意控制曝光時間以避免光漂白

【常見問題與解決方案】

問題一：熒光信號弱或檢測不到

· 可能原因：注射體積不足、存活時間過短、注射位點偏離目標、 微球未充分混勻、顯微鏡濾光片不匹配

· 解決方案：增加注射體積至推薦范圍上限；延長存活期至 7 天以上；確認立體定位坐標準確性；注射前充分渦旋；確認使用FITC/GFP 通道觀察

問題二：背景自發熒光高

· 可能原因：醛類固定劑（特別是戊二醛）產生組織自發熒光、封片劑含熒光雜質、切片過厚

· 解決方案：使用低自發熒光的封片劑；如必須含醛固定，可嘗試處理切片以降低醛類自發熒光；控制切片厚度在30–40 µm

問題三：注射位點擴散范圍過大

· 可能原因：注射速度過快、注射體積過大、針頭口徑過粗、留針時間不足

· 解決方案：降低注射速率至 0.1 µl/min 以下；減少注射體積；使用更細的針頭（32–33 G）；延長留針時間至 10 分鐘

問題四：熒光信號快速淬滅

· 可能原因：觀察時激發光過強、暴露時間過長、未使用抗淬滅封片劑

· 解決方案：使用抗熒光淬滅封片劑（如含 DABCO 或ProLong Gold 的產品）；降低激發光強度；縮短單次曝光時間；盡快拍照存檔

問題五：微球堵塞針頭

· 可能原因：微球濃度過高、針頭過細、懸浮液靜置過久產生沉降

· 解決方案：注射前充分渦旋并間歇振蕩；可使用適當稀釋的懸浮液；避免靜置超過 30 分鐘；必要時更換更大口徑針頭

問題六：陽性細胞數量少

· 可能原因：靶區神經末梢密度低、投射通路稀疏、運輸距離過長、動物品系差異

· 解決方案：增加注射位點數量（多點注射）；延長存活期；適當增大注射體積；參考同類文獻確認預期標記強度

問題七：免疫組化染色效果不佳

· 可能原因：固定過度導致抗原表位遮蔽、抗體濃度不當、通透步驟不充分

· 解決方案：控制固定時間在 4–24 小時內；優化抗體滴定；使用 0.3% Triton X-100 通透 30 分鐘；進行抗原修復 處理

問題八：與其他熒光標記串擾

· 可能原因：濾光片帶寬過寬、多色標記光譜重疊

· 解決方案：使用窄帶濾光片；合理安排多色實驗的通道分配；采集時分離通道逐一拍照后合成

【注意事項】

1. 本產品僅供科研使用（For Research Use Only），不得用于臨床診斷或治療

2. 操作時請佩戴防護手套、護目鏡及實驗服

3. 避免吸入氣溶膠或接觸皮膚、黏膜

4. 如懸浮液不慎接觸皮膚，立即用大量清水沖洗

5. 嚴禁冷凍保存，冷凍會導致微球不可逆聚集

6. 每次取用前務必渦旋混勻，確保微球均勻分散

7. 建議使用低自發熒光的試劑和耗材，以降低背景干擾

8. 熒光觀察時盡量縮短曝光時間，延長樣本可觀察壽命

9. 不同批次間熒光強度可能存在微小差異，建議同一實驗組使用同一批次產品

10. 廢棄樣本及耗材請按照實驗室生物廢棄物處理規范處置

【參考文獻】

1. Katz LC, Iarovici DM. Green fluorescent latex microspheres:  a new retrograde tracer. Neuroscience. 1990;34(2):511-520.

2. Lanciego JL, Wouterlood FG. A half century of tracing neuronal connections with horseradish peroxidase and fluorescent substances. J Chem Neuroanat. 2011;42(4):157-161.

3. Schmued LC, Fallon JH. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Res. 1986;377(1):147-154.

4. Wessendorf MW. Fluoro-Gold: composition, stability and suitability for retrograde labeling. J Neurosci Methods. 1991;38(1-2):1-17.

5. Veenman CL, Reiner A, Honig MG. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 1992;41(3):239-254.

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業常規信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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